Ce factori determină solubilitatea peptidelor?
Ocazional, unul dintre cele mai dificile aspecte ale efectuării cercetărilor cu peptide sintetice poate fi determinarea celui mai eficient solvent în care să se dizolve peptida. Multe peptide se dizolvă ușor în soluții apoase (apă sterilă), dar unii cercetători pot întâmpina probleme legate de solubilitatea scăzută sau chiar insolubilitatea, în special atunci când lucrează cu peptide care conțin secvențe lungi de aminoacizi hidrofobi. Cu toate acestea, cercetătorii pot prezice solubilitatea oricărei peptide studiind caracteristicile cunoscute ale aminoacizilor săi individuali.
Solubilitatea unei peptide este determinată în principal de proprietățile fizice ale aminoacizilor săi. Aminoacizii pot fi clasificați ca bazici, acizi, polari neîncărcați sau nepolari. Aminoacizii nepolari sunt hidrofobi (nu se dizolvă în soluții apoase). Peptidele care conțin un număr relativ mare de aminoacizi nepolari sau aminoacizi polari neîncărcați se dizolvă, în general, mai eficient în solvenți organici precum DMSO, propanol, izopropanol, metanol sau DMF. Peptidele cu un conținut ridicat de aminoacizi acizi pot fi de obicei dizolvate în solvenți bazici (cum ar fi hidroxidul de amoniu, deși acest lucru nu ar trebui utilizat cu peptide care conțin Cys) și, invers, peptidele care conțin un număr relativ mare de aminoacizi bazici pot fi, în general, dizolvate eficient în solvenți acizi (cum ar fi soluția de acid acetic). Cu toate acestea, cercetătorii ar trebui să încerce întotdeauna să dizolve mai întâi peptidele în apă sterilă, în special atunci când peptida conține mai puțin de cinci reziduuri (aminoacizi), deoarece aceste peptide se dizolvă, în general, destul de ușor în apă.
Indicații privind solubilitatea peptidelor
Cercetătorii ar trebui să testeze întotdeauna solubilitatea peptidelor cu o cantitate mică de peptidă în cazul în care inițial nu se atinge solubilitatea ideală. Peptidele ar trebui lăsate să se încălzească la temperatura camerei înainte de a încerca să fie dizolvate în soluție. Dacă încercările de a dizolva peptida în soluție sterilă de apă nu reușesc, cercetătorii ar trebui să încerce în continuare soluții care pot fi îndepărtate prin liofilizare; dacă nici acești solvenți nu sunt eficienți, pot fi îndepărtați prin procesul de liofilizare, permițând cercetătorului să o ia de la capăt fără a pierde sau compromite peptida.
Pentru a ajuta la solubilitate, se poate utiliza o ușoară încălzire a soluției (mai puțin de 40 de grade Celsius sau 104 grade Fahrenheit) sau tehnici de sonicare. Cu toate acestea, aceste tehnici vor ajuta doar la dizolvare; ele nu vor altera caracteristicile inerente de solubilitate ale unei peptide.
Prezicerea caracteristicilor solubilității peptidelor
Pentru a prezice caracteristicile de solubilitate ale unei anumite peptide, cercetătorul trebuie mai întâi să evalueze compoziția în aminoacizi a peptidei, deoarece numărul și tipurile de sarcini ionice din peptidă influențează solubilitatea. Mai exact, trebuie determinat dacă peptida este acidă, bazică sau neutră. Pentru a stabili acest lucru, se urmează pașii următori:
1. Atribuiți valoarea -1 reziduurilor acide (aminoacizilor). Acestea includ Asp (D), Glu (E) și capătul C-terminal (COOH).
2. Atribuiți o valoare de +1 fiecărui reziduu bazic. Acestea includ Lys (K), Arg (R) și NH2 N-terminal.
3. Atribuiți o valoare de +1 fiecărui reziduu His (H) la pH 6.
4. Calculați sarcina netă totală a peptidei prin adunarea numărului total de sarcini ale peptidei.
Dizolvarea peptidei în soluție
Odată ce sarcina netă totală a peptidei a fost calculată, se pot face predicții privind solubilitatea, iar cercetătorul poate trece la dizolvarea peptidei în soluție. Este important să încercați mai întâi să dizolvați peptida în soluție sterilă de apă. Dacă apa nu este eficientă, urmați următoarele instrucțiuni:
• Dacă sarcina netă totală a peptidei este pozitivă, încercați să dizolvați peptida într-o soluție de acid acetic (10%-30%). Dacă acest lucru nu reușește, încercați TFA (< 50 μl).
• Dacă sarcina peptidei este negativă, încercați să dizolvați peptida cu hidroxid de amoniu (NH4OH; < 50 μl). Totuși, dacă peptida conține Cys, nu utilizați hidroxid de amoniu; în schimb, adăugați o cantitate mică de DMF.
• Dacă peptida este neutră (sarcină netă totală de 0), solvenții organici sunt în general cei mai eficienți. Încercați acetonitril, metanol sau izopropanol. Dacă peptida este foarte hidrofobă, încercați să o dizolvați într-o cantitate mică de DMSO. Atenție: peptidele care conțin cisteină, metionină sau triptofan sunt predispuse la oxidare de către DMSO. În plus, unele peptide tind să se agrege (gel); pentru aceste peptide, adăugați 6 M guanidină•HCl sau 8 M uree.
După ce peptida a fost dizolvată cu succes, diluați soluția de peptidă la concentrația dorită prin adăugarea lentă a soluției de peptidă într-o soluție tamponată. Agitați ușor, dar constant, în timp ce combinați, pentru a monitoriza vizual și a preveni concentrația localizată a peptidei în soluția apoasă. Se recomandă prepararea soluției stoc de peptidă la o concentrație mai mare decât cea necesară testului experimental: soluția stoc de peptidă poate fi apoi diluată în continuare cu tamponul de test.
Odată ce soluția de peptide a fost preparată, aceasta trebuie împărțită în alicote, după cum este necesar, și depozitată la -20°C (-4°F). Pentru acele peptide care conțin cisteină, metionină sau triptofan, preveniți deteriorarea prin oxidare prin depozitarea lor într-un mediu fără oxigen.